Auricher Wissenschaftstage –
Forum einer dritten Kultur
Praktikum im Heidelberger Life-Science Lab des dkfz
vom 17. bis zum 28. Juni 2013
Von Mareike Hicken und Tomke Schmidt
dkfz-Gebäude
Vom 17.06.2013 bis zum 28.06.2013 haben wir (Mareike Hicken und Tomke Schmidt) an einem Lehrpraktikum im Life-Science Lab des Deutschen Krebsforschungszentrums teilgenommen. Das Life-Science Lab ist ein Schülerlabor und hat uns den Erwerb praktischer Laborerfahrung auf individueller Basis ermöglicht.
Bereits am 16.06.2013 sind wir abends in Heidelberg, der für ihre Forschung bekannten Großstadt in Baden-Württemberg, angekommen. Am Montagmorgen startete dann das Praktikum mit vier weiteren Interessierten im Life-Science Lab. Nach der Ablaufbesprechung, der Unterweisung in der Gentechnik-Sicherheitsverordnung (GenTSV) und der Pipetteneinweisung, fingen wir mit dem ersten Teil des Laborführerscheins an, den wir dort in der ersten Woche absolvierten.
Unser Arbeitsplatz
Teil 1 ist der Basiskurs in Molekularbiologie, bei dem wir molekularbiologische Techniken erlernt haben. Dieser fing mit der Herstellung einer Plasmid-Minipräparation mittels alkalischer Lyse an, um die DNA zu präpizitieren und um dann einen Restriktionsverdau durchzuführen. Die erfolgreiche Präpizitation und der erfolgreiche Restriktionsverdau wurden dann von uns mittels einer Agarosegelelektrophorese nachgewiesen. Schließlich gossen wir Agarplatten und impften kompetente Bakterien (hier: E. coli DH5α) an. In diese brachten wir am Dienstag durch Transformation zwecks der Amplifikation Plasmid-DNA ein, auf den Agarplatten wurden sie schließlich angeimpft. Die einzelnen transformierten Bakterien wachsen dann auf Grund der Amplifikation (hier: die gezielte Vermehrung von bestimmten DNA-Abschnitten, also der eingeführten Plasmid-DNA) zu einer makroskopischen sichtbaren Kolonie an.
Arbeiten an einer Sterilbank
Am Mittwoche begann Teil 2, also die Grundlagen der Zellbiologie mit der Arbeit an einer Sterilen Werkbank/Sterilbank, um HeLa-Zellen (also Zellen des Zervixkarzinoms / Gebärmutterhalskrebs) ohne Kontamination zu kultivieren. Danach ermittelten wir die Zellzahl und Vitalität der Zellen mittels der Neubauer-Zählkammer, was in der Forschung dabei hilft Krebszellen zu untersuchen.
Pipettieren für den ELISA, 96-Well Platte
Schließlich folgte die Apoptose bzw. Nekrose (also der Zelltod) von humanen Lymphozyten (hier: lebende humane Leukämie Zellen, Jurkat T-Zellen). Den Zellen wurde in einer 96-Well Platte eine bestimmt ansteigende Menge eines Todesliganden zugeführt, ebenfalls wurden sie bei 60° Celsius erhitzt, die Ergebnisse sollten wir vergleichen, sprich die Anzahl der toten Zellen vergleichen. Nachmittags führten wir die Transfektion von Grün-Floureszierendem Protein (GFP) von humanen epithelialen Zellen (293 T) mit der Kalziumphosphat Methode durch, um das GFP schließlich in der DNA mittels eines Fluoreszenzmikroskop nachweisen zu können.
Gelelektrophorese
Am Donnerstag begann Teil 3 und damit der letzte Teil des Laborführerscheins: Proteinbiochemische Methoden. Diesen Teil begannen wir mit der SDS-PAGE (engl.: sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophorese), einer Gelelektrophorese zur Auftrennung, Färbung durch Coomassie und schließlich zur Charakterisierung der Proteine (mit Hilfe eines bestimmten Scanners für diesen Versuch. Nachmittags besuchten wir einen Vortrag über Psychoimmunology of cancer von Prof. Cohen.
Freitagvormittag beschäftigten wir uns mit der Proteinbestimmung nach Bradford, um eine Konzentrationsbestimmung von Proteinen durchzuführen (hier: BSA = Serumalbumin vom Rind in einer Lösung von verschiedenen Konzentrationen). Danach besuchten wir zwei Vorträge über Tumorimmunologie von Prof. Arnold und Dr. Gergel. Nachmittags hatten wir eine Campusführung und einen Besuch im Tierforschungslabor, in dem Krebs an Tieren untersucht wird und daraus z. B. Krankheitsverläufe herausgefunden werden und neue Medikamente entwickelt werden.
DNA-Nachweise bei PCR nach einer Gelelektrophorese
Nach dem freien Wochenende begann die zweite Woche mit dem PCR-basierten Nachweisverfahren. Mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (engl.: polymerase chain reaction = PCR) kann man Kopien von DNA-Segmenten erzeugen. So kann später nachgewiesen werden, welchen Gensequenzen vorliegen und es lässt sich damit beispielsweise Spezies, Geschlecht oder Verwandtschaftsgrad der genomischen DNA bestimmen. Zuerst führten wir die semiquantitative PCR durch, bei der wir das Enhanced Green Floureszenz Protein amplifizierten, diese Gensequenzen kopierten und durch eine Gelelektrophorese auftrennten und nachwiesen.
Am Dienstag führten wir die real-time PCR durch, bei dem man in Echtzeit die Entstehung von der neuen DNA verfolgen kann. Dies wird durch Zugabe eines DNA-Farbstoffes möglich, der nach Einlagerung in die DNA fluoresziert (z. B. Cyber Green, welches mit blauem Licht grün emittiert, also leuchtet).
Am Mittwoch transfizierten wir HeLa-Zellen mit verschiedenen Farbstoffen und bestimmte Bereiche der Zelle unter einem Fluoreszenzmikroskop erkennen zu können. Z. B. DAPI um die DNA zu färben, PJ um DNA und RNA zu färben, WGA um die Zellwand/-membran zu färben und Mitrotracker-Red, welches sich in den Mitochondrien anlagert. Unter einem speziellen Floureszenzmikroskop mit verschiedenen Wellenlängen kann man diese Bereiche dann erkennen.
Am Donnerstag führten wir dann den Nachweise von Proteinen im ELISA. Mit Hilfe des „Enzyme Linked Immuno Sorbet Assay“ lassen sich Antigene in vielen Proben nachweisen. Hierzu werden Proteine aus einer Testlösung in an den Kunststoff der 96-Well Platten gebunden und mit Antikörpern inkubiert. Die entstehenden Antigen-Antikörperkomplexe werden mit Hilfe eines enzymgekoppelten sekundären Antikörpers über eine Enzym-Substratreaktion nachgewiesen (hier: Horse Radish Peroxidase, als Substrat dient o-Phenylenediamin, die Enzym-Substratreaktion ist hier eine Gelbfärbung, also eine Oxidation zu Nitrophenol). Damit beendeten wir unser Praktikum, da am Freitag unser Abreisetag war.