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Aufenthalte am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg (II)

Praktikumsbericht

Praktikum im Heidelberger Life-Science Lab des dkfz
vom 23. Juli bis zum 3. August 2012
Von Nadja Ginsheimer

Ich, Nadja Ginsheimer, sowie meine Mitschülerin Jana Edzards von der BBS 2 Aurich und die vom Gymnasium Ulricianum Aurich kommende Schülerin Zoe Beccard haben im Zeitraum vom 23.07.12 – 03.08.12 ein zweiwöchiges Praktikum im Life-Science-Lab (Schülerlabor) des dkfz (Deutsches Krebsforschungszentrum) in Heidelberg gemacht. Betreut wurden wir in dem gesamten Zeitraum von der Biologielaborantin Anja Reimann und Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Rüdiger Arnold.

Nachdem wir am späten Nachmittag des 23.07.12 ankamen, wurde uns ein kurzer Sicherheitsvortrag mithilfe einer kleinen Power-Point-Präsentation vorgeführt. Da es sich nicht mehr lohnte bereits mit dem Praktikum anzufangen, wurden wir anschließend entlassen. Am nächsten Tag bekamen wir einen Einblick in das speziell für Schüler eingerichtete Labor, das Life-Science Lab. Zunächst erhielten wir Laborkittel und feste, geschlossene Schuhe, die zum Laboralltag gehören. Anschließend wurden uns die Arbeitsplätze und die dort vorhandenen wichtigen Laborarbeitsmaterialien gezeigt und deren Umgang anschaulich erklärt.

Ein wichtiges Arbeitsmaterial sind Pipetten, die es in verschiedenen Größen gibt und die für die tägliche Laborarbeit unerlässlich sind. Nach anfänglichen Pipettierübungen bekamen wir Skripte, auf denen unsere Arbeitsvorgänge geschildert waren.

In der ersten Woche beschäftigten wir uns hauptsächlich mit Plasmid-DNA und dem Magenbakterium Escherichia coli (E. coli). Zu allererst stellten wir transformationskompetente Bakterien her, die allerdings von der stationären Phase wieder in die exponentielle Wachstumsphase gebracht werden mussten, damit sie kompetent gemacht werden konnten. Deswegen gaben wir 20 mL (Mikroliter) Medium (37 Grad) in einen Erlenmeyerkolben und impften diesen mit 20 mL der Bakterienkultur. Nun musste die Mischung 1 h bei 37 Grad geschüttelt werden (Inkubation). Dabei erreichten die Bakterien die optimale Wachstumsphase. Nach einer Stunde machten wir die Bakterien kompetent, indem wir die Bakterienlösung bei 3.000 Umdrehungen für 10 min bei 4 Grad abzentrifugierten.

Der flüssige Überstand konnte in einen Abfallbehälter gekippt bzw. pipettiert werden. Unten am Eppendorfgefäß bildete sich durch das Abzentrifugieren ein Überstand, auch genannt Pellet. Anschließend wurde ein Puffer genutzt um das Pellet zu resuspendieren, das heißt, der Puffer wird aufgesogen und mit Kraft auf das Pellet gegeben. Das wurde so oft wiederholt, bis das Pellet sich gelöst hatte. Danach wurden die resuspendierten Bakterien für 1 h auf Eis gestellt. Nach 1h füllten wir 100 mL der Bakteriensuspension in Eppendorfgefäße ab und schockgefrierten sie im flüssigen Stickstoff (-80 Grad). Nun war die Transformation der Bakterien an der Reihe, da sie nun kompetent genug waren. Die Transformation ist dazu da Plasmid-DNA in die Bakterien einzubringen. In den kompetenten Bakterien vermehren sich die Plasmide. Für die Transformation mussten wir erstmals eine DNA Lösung herstellen, die aus sterilem Wasser, Puffer und DNA bestand. Nach dem Auftauen der Bakteriensuspension wurde die DNA Lösung zur Bakteriensuspension gegeben und durch schnippen mit dem Finger gemischt. Im Folgenden musste die Bakteriensuspension erst 20 min auf Eis inkubieren und darauffolgend 10 min bei Raumtemperatur. Danach wurde 900 mL vorgewärmtes LB-Medium zu den Bakterien gegeben. Zur Induktion (Einführung) der Antibiotika-Resistenzen musste die Suspension 40-60 min 37 Grad inkubiert werden. In dieser Zeit bereiteten wir die Agarplatten vor, auf denen die Bakterien anschließend wachsen sollten. Doch damit die Bakterien optimal wachsen konnten, stellten wir eine LB-Agar-Antibiotikalösung her, die aus dem LB Medium, Agar (Polysaccharid/Stärke) und dem Antibiotikum Ampicillin besteht. Diese gossen wir in 10cm Petrischalen ca. 2 cm hoch. Dazu wurde die Bakteriensuspension gegeben und über Nacht im Brutschrank inkubiert. Die Übernachtkulturen dienen der Vervielfältigung der Plasmid-DNA und können zur Plasmid Gewinnung führen.

Am folgenden Tag führten wir mit den Bakterien eine Alkalische Lyse durch, die den Sinn hatte, die Zellwände sowie die DNA zu denaturieren. Um das zu erreichen, entnahmen wir 1–1,5 mL unserer Bakteriensuspension und überführten diese in ein Eppendorfgefäß, dieses wurde dann zentrifugiert. Der flüssige Überstand wurde pipettiert und das am Boden gebliebene Pellet mit einem Puffer resuspendiert und anschließend auf Eis gestellt. Ein weiterer Puffer wurde hinzugegeben und durch mehrmaliges Invertieren gut gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 5 min wurde dasselbe noch einmal mit einem dritten Puffer wiederholt und nach weiteren 5 Minuten Inkubationszeit bei Maximaldrehzahl zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die wässrige überbleibende DNA-Lösung musste desweiteren gefällt und gelöst werden. Das diente der Konzentrierung von DNA und der Entsalzung der Lösung. Um die DNA zu „fällen“ wurde 900mL reines Ethanol zur DNA-Lösung gegeben, kurz durch starke Vibrationen (vortexen) durchgeschüttelt, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und 15 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde weggeschüttet und das überbleibende Pellet wurde mit 70% Ethanol „gewaschen“. Danach noch für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und verworfen. Um die DNA trocknen zu lassen stellten wir es für 5 min in einen Thermomixer.

Danach wurde ein Puffer hinzugegeben und im Thermomixer bei 37 Grad für 15 min unter Schütteln gelöst. Danach sofort wieder auf Eis gestellt. Nun wendeten wir spezielle Restriktionsenzyme an, um die DNA Moleküle an bestimmten Schnittstellen zu trennen. Die Lösung für die Reaktion stellten wir selbst her, indem wir 5mL Plasmid-DNA, 2mL Puffer, 0,5mL Des Enzyms EcoRI und 12,5mL Wasser miteinander vermischten und für 1 Stunde, bei 37 Grad in den Thermomixer stellten. Um die DNA Fragmente unter UV Licht sichtbar zu machen, stellten wir ein spezielles Agarosegel her.

Das geschah indem wir 1g Agarosepulver mit 100mL eines Puffers auffüllten, kurz in der Mikrowelle aufkochten und anschließend unter kaltem Wasser abkühlten. Danach wurde noch 1,5mL / 100mL vom Serva DNA Gel Stain Clear G hinzugegeben. Diese Mischung wurde blasenfrei in einen speziellen Gelschlitten gegossen. Nachdem das Gel ausgehärtet war, zogen wir weiße Kämme vorsichtig heraus, die die Taschen für die DNA-Lösungen gebildet hatten. Der Gelschlitten wurde in eine spezielle Apparatur der Elektrophoresekammer gelegt und mit einem Puffer aufgefüllt. In den vorhandenen Taschen (entstanden durch die Kämme) wurden pro Person 6 verschiedene Lösungen pipettiert.

Die erste Lösung war ein blauer Marker (5mL), danach folgten jeweils zwei unverdaute Minipräparationen (DNA-Lösung ohne Restriktionsenzymen) und zwei verdaute Minipräparationen (DNA-Lösung mit Restriktionsenzymen). Zum Schluss folgte noch ein Kontrollplasmid (pGEX-KO). Nachdem die Lösungen dazugegeben wurden, wurde Spannung (100V-120V) eingestellt und die Agarosegelelektrophorese startete. Nach 45-90 Minuten des Gellaufs wurde es unter UV Licht fotografiert, um die DNA Fragmente besser sehen zu können. In den folgenden Tagen führten wir eine PCR (polymerase chain reaction, zu Deutsch: Polymerase-Ketten-Reaktion) durch, welche den Sinn hat , beliebig viele DNA-Segmente aus nur einer DNA herzustellen. Damit die PCR erfolgreich verlaufen konnte, stellten wir zuerst einen Mastermix da, der aus Wasser, einem Templat (ein Templat spiegelt die Nucleotidsequenz eines komplementären Strangs wieder), 2 verschiedene Primer (komplementäre Basenabschnitte, welche an dem lückenhaften DNA-Abschnitt angebracht werden), PCR Mix (hilfreich für die Neusynthese der DNA). Diesen Master Mix gaben wir dann zu unserer DNA. Nun folgten wir dem Schema der PCR. Zu aller erst erhitzten wir unsere DNA für 3–5 min bei 95 Grad um die beiden DNA-Stränge durch Hitzedenaturierung zu trennen (Precycle). Dann lagern sich bei 53-62 Grad die komplementären Primer an den gewünschten DNA-Abschnitten an (Annealing). Das benötigte weitere 30-45 sek. Anschließend endete der Zyklus mit der Neusynthese der DNA bei 72 Grad für 1 min (Elongation). Es können noch zwei weitere Schritte folgen, die jedoch nicht erforderlich sind (Postcycle, dabei werden unvollständige Kopien aufgefüllt und die Kühlung ist für die Lagerung sinnvoll). Da die PCR eine zyklische Reaktion ist, kann sie beliebig oft angewendet werden, sodass in ca. 2 Stunden über 1 Milliarde Kopien der gewünschten DNA hergestellt werden können.

Die zweite Woche widmeten wir der Zellkultur und den Proteinen. Am Anfang der Woche wurde uns das Arbeiten an der Sterilarbeitsbank gezeigt, welches wir in Dreier-Gruppen an unseren Arbeitsplätzen durchführten, da ein immenser Zeitaufwand für die Arbeit jedes Einzelnen Praktikanten nötig wäre und diese fehlte.

Durch steriles Arbeiten setzten wir Zellen von einem Behälter in den anderen um und verfolgten in den kommenden Tagen deren Zellwachstum, welches bewies wie steril gearbeitet wurde. Dazu desinfizierten wir unsere Arbeitsfläche mit Ethanol und zogen uns Handschuhe über. Zuerst entfernten wir das Medium des alten Behälters, welches die Nährlösung der Zellen war. Anschließend nutzten wir einen Puffer (TBS) um das Gefäß im Inneren zu reinigen. Dabei beachteten wir besonders den Erhalt der Zellen. Um die am Boden haftenden Zellen vorsichtig und ohne Beschädigung so sorgfältig wie möglich zu entfernen, nutzten wir frisches Medium und resuspendierten die Zellen so gut wie möglich. Das Medium mit den Zellen überführten wir in ein Eppendorfgefäß und zentrifugierten es kurzzeitig. Währenddessen füllten wir frisches Medium in einen frischen Zellbehälter. Den Überstand aus dem Eppendorfgefäß kippten wir weg und fühlten ein wenig vom Medium in das Eppendorfgefäß, resuspendierten dies erneut, um die am Boden haftenden Zellen mit dem Medium zu vermischen. Zum Schluss wurde diese Mischung in den mit Medium gefüllten Zellbehälter zugeführt, kurz geschwenkt und in den 37 Grad warmen Brutschrank zur Vermehrung gestellt.

Während die eine Gruppe das sterile Arbeiten „erlernte“, beschäftigte sich die andere Gruppe mit dem Ermitteln von Zellzahlen mit der Neubauer-Zählkammer.

Mithilfe der Neubauer Zählkammer kann man die Anzahl der lebenden Zellen ermitteln, indem man die 4x4 Großen Quadrate nimmt und deren Zellen mithilfe des Mikroskops zählt. Da wir ermitteln wollten wie viele lebenden Zellen es gibt, färbten wir alle Zellen mit einem Trypanblau. Alle toten Zellen wurden hierdurch blau gefärbt, da die Zellmembran derart beschädigt war, dass sie die Farbe nicht abhalten konnte ins Zellinnere zu dringen. Alle anderen Zellen, die lebten, färbten sich nicht blau. Nachdem wir die Zellanzahl aus den vier Quadraten ermittelt hatten, wurde die Zahl durch vier geteilt, um den Mittelwert zu erhalten. Der Mittelwert wurde durch 2 dividiert, die der Verdünnung entsprach und mit 104 multipliziert. Das Ergebnis gab die Zellen/ ml an.

In den nächsten Tagen beschäftigten wir uns mit der Expression und Affinitätsreinigung von Fusionsproteinen aus den Bakterien Escherichia coli. Zur Vorbereitung stellten wir Eis in Styropor Behälter bereit und die Schüttelinkubatoren auf 37 Grad. Für die Genexpression, welche sich auf die Synthese von Proteinen und RNA aus den genetischen Informationen bezieht, mussten wir erstmals die Vorkulturen verdünnen und induzieren, um den Promoter aktivieren zu können, der dann die DNA abliest und das gewünschte Genprodukt herstellt. Dazu wärmten wir Medium an und gaben die entsprechende Menge Ampicillin dazu. Dies füllten wir in einen Erlenmeyerkolben um und impften es mit der Vorkultur an. Einen geringen Teil bewahrten wir auf Eis auf. Der Rest wurde bei 37 Grad geschüttelt und inkubierte in den 45 min. Anschließend gaben wir ein wenig IPTG dazu, um die Induktion zu starten und stellten dies dann für 1,5–2 Stunden in die Schüttelinkubatoren, wo die Inkubation weitergeführt wurde. Nach der vorgegebenen Zeit widmeten wir uns dem Ernten und Aufschließen der Bakterien, um an die genetischen Informationen, speziell die der Proteine zu gelangen. Wir gaben die Bakteriensuspension auf zwei Spitzbodenröhrchen und zentrifugierten diese für 10 min.

Kurz danach gaben wir einmal einen speziellen Puffer zu einer Mischung und Methanol/Trockeneis bzw. Flüssigstickstoff zur anderen Mischung. Damit sollten wir ausprobieren, welches Verfahren am Ende effektiver ist. Die letzten Tage haben wir uns noch mit Nekrose und Apoptose beschäftigt. Erst wurde uns in einem Vortrag erklärt, was der Unterschied zwischen ihnen ist. Apoptose ist der programmierte Zelltod des Körpers, während die Nekrose ein Zelltod durch äußere Einflüsse ist. Außerdem lernten wir noch, wann und wo Apoptose und wann Nekrose stattfindet und warum Tumoren bei einem Ausfall von Apoptose auftreten. Dann durften wir diese Zelltodarten praktisch im Labor kennen lernen. Wir bekamen eine Zellkultur und überführten diese in mehrere kleinere Eppendorfgefäße . Dann sollten wir unterschiedliche Mengen Antikörper zu den Zellkulturen beigeben und vier unterschiedliche Einflüsse erzeugen, die eine Nekrose der Zellen hervorrufen. Einige von uns entschieden sich für Schockgefrieren, zus tarkes Erhitzen oder durch Resuspendieren mit einer engen Nadel. Dann schauten wir uns die Zellen unter dem Mikroskop an und sahen, dass die Antikörper perfekt gewirkt hatten, das heißt, dass alle Zellen abgestorben sind. Bei den meisten versuchten äußeren Einflüssen, die wir versucht haben, haben wir nicht so ein gutes Ergebnis bekommen, da nur einige Zellen gestorben sind.

Mit dieser Arbeit endete unser Praktikum auch. Hätten wir unser Praktikum länger antreten können, hätten wir uns noch die richtige Laborarbeit von den Wissenschaftlern des dkfz ansehen können. Obwohl es schade ist, dass wir das nicht mehr machen konnten, war das Praktikum sehr lehrreich. Wir haben alle grundlegenden Aspekte der Laborarbeit kennen gelernt und auch in der Theorie wurde uns sehr viel beigebracht. Daher bedanken wir uns auch bei allen, die uns dieses Praktikum ermöglicht haben, und denen die uns währenddessen betreut haben.